角膜共焦显微镜早期诊断兔高危角膜移植排斥反应的价值

方法：制作兔角膜碱烧伤模型，36d后行穿透性角膜移植，于角膜移植术后4,9,14,21～28d诊断排斥反应时，角膜共焦显微镜检查角膜。

结果：排斥反应时角膜共焦显微镜检查见角膜植片炎性细胞浸润，角膜细胞丢失，新生血管生长。

结论：角膜共焦检查有助于早期诊断排斥反应。

【关键词】  角膜共焦显微镜；角膜移植；排斥反应

Early detection of high risk corneal graft rejection in rabbit by corneal confocal microscope

Ling Wang , Jie Wu , XiuPing Zhu , Hua Yang , Yong Yin

Ophthalmology Institute of Xian City, Xian 710002, Shaanxi Province, China

Abstract
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AIM: To investigate the corneal graft rejection by alkali burned in rabbits corneal under corneal confocal microscope and to find a way of early detection on corneal graft rejection.
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METHODS: Made a model of alkali burned in corneal of rabbits. At 36 days after alkali burning, penetrating keratoplasty was performed. Corneal confocal microscope was used to detect the corneal at day 4, 9, 14 and 34 weeks when the graft rejection was diagnosed after the operation.
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RESULTS: Corneal cells loss, new vessels ingrowth, and inflammatory cells were detected in corneal at the time of rejection by corneal confocal microscope.
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CONCLUSION: Corneal confocal microscope is useful in the early detection of corneal graft rejection.
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KEYWORDS: corneal confocal microscope; corneal graft rejection; graft rejection

0　引言
   
目前角膜疾病仍是致盲的主要原因之一。自1905年Zim成功的完成人类第1例同种异体穿透角膜移植手术以来，至今角膜移植手术已成为全身组织移植成功率高的手术。然而术后的排斥反应仍是导致手术失败的头号并发症。尤其是高危角膜移植，术后排斥反应的发生率高达65%以上[1]。角膜移植排斥反应的机制仍未完全明了，早期诊断依然是临床上一个挑战性的问题。早期诊断对早期治疗及预后发挥着重要的作用。迄今早期诊断主要依据患者的主诉及临床检查（如视朦、移植片透明度改变等）作出综合判断。由于缺乏足够的活体的客观指标，该症的早期诊断与亚临床型诊断仍存在一定的困难，因而往往在明确诊断时角膜移植片的各层细胞（特别是内皮）细胞已遭到不可逆性的损害，此时虽能给予正确的治疗，但仍有相当比例的患眼植片破坏，从而导致移植手术的失败。我们建立兔角膜碱烧伤后高危角膜移植排斥反应模型，通过共焦显微镜对角膜植片进行动态活体的病理观察，探讨高危角膜移植排斥反应发生的机制，寻找早期诊断的客观指标。

1　材料和方法

1.1　材料  健康新西兰大白兔24只，由西安交通大学医学部动物实验中心提供，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg。供体8兔16眼，受体16兔，随机分为2组，单眼选用，角膜碱烧伤组及正常对照组各8兔８眼。实验组兔角膜中央放置直径4mm被1mmol/L NaOH浸湿的滤纸片1min，大量生理盐水冲洗，造成兔角膜碱烧伤模型[2]。观察至36d。对照组及实验组烧伤36d时行穿透性角膜移植手术，速眠新Ⅱ注射液（长春军需大学兽医研究所），0.1～0.2ml/kg im麻醉，用直径6mm及6.5mm的环钻制备植床及植片，100缝线间断缝合，消毒空气形成前房。隔日裂隙灯检察。

1.2　方法  角膜共焦显微镜（confoscan 3.0,Model P3）角膜移植术后4,9,14,21～28d进行检查及眼前节照相。移植片存活（是、否）；排斥反应发生（是、否），排斥反应诊断按照Holland 等[3]标准；植片上新生血管（有、无）；并发症：前房出血、虹膜后粘连、角膜穿孔、感染（有、无）。

2　结果
   
碱烧伤后36d的共焦检查见角膜水肿明显消退，新生血管变细、变少。内皮面窥不清，基质层可见瘢痕，浅基质层可见少许炎性细胞及新生血管。角膜移植术后4d：对照组与实验组植片透明，创缘处轻度水肿，前房存在。角膜共焦检查实验组及对照组可见基质细胞水肿，基质层炎性细胞浸润，上皮基底层结构大致正常（图1A,B）。角膜移植术后9d： 对照组及实验组植片均透明，实验组少许细小新生血管顺缝线生长。对照组及实验组植片均见基质层结构紊乱，基质细胞肿胀，细胞数目减少，实验组较对照组细胞外炎性渗出明显。角膜移植术后14d：对照组植片中央透明，创缘处灰白色瘢痕形成。实验组植片中央透明，创缘处灰白色呈环状扩展，部分细小密集的新生血管顺缝线长入植片。实验组及对照组见基质细胞肿胀，基质层瘢痕形成，实验组较对照组角膜基质细胞减少，实验组植片周边可见细小新生血管。角膜移植术后21～28d：对照组植片透明，创缘处淡灰色浑浊。实验组：创缘处浑浊灶向植片环行扩展，植片创缘处水肿,新生血管明显长入植片。对照组所见大致同角膜移植术后14d（图2A）。实验组：内皮面窥不清，基质层水肿，基质细胞减少，细胞肿胀，基质层瘢痕形成，细胞外渗出明显，基质层及上皮层较多炎性细胞浸润（图2B）。植片边缘可见粗大新生血管，管腔内可见较多炎性细胞，反光较强。

图1角膜移植术后4d角膜共焦显微镜检查（略）  

A:对照组基质细胞肿胀，边界不清，炎性渗出，少许炎性细胞浸润;B:实验组基质细胞肿胀，可见炎性细胞浸润

图2角膜移植术后21～28d角膜共焦显微镜检查（略）  

A:对照组基底膜细胞完整，浅基质层细胞减少;B:实验组可见新生血管，炎性细胞浸润

3　讨论
   
角膜移植是重要的复明手术之一，免疫排斥反应是手术失败的主要原因，特别是碱烧伤角膜移植术后免疫排斥反应发生几率更高，临床上目前尚缺乏有效手段对角膜移植排斥反应作出早期诊断[4]，早期诊断仍是一个亟待解决的问题。角膜移植术后免疫排斥反应是一个复杂且有多因素参与的过程，其发生机制目前仍不清楚[5]。我们建立碱烧伤后高危角膜移植排斥模型，用碱烧伤兔角膜中央，诱导植床的血管化和炎症背景，增加角膜移植排斥的风险，观察至烧伤后36d，共焦检查未见明显炎性细胞浸润，提示炎症基本静息，再行角膜移植术，术后局部不点激素类及免疫抑制药物以免抑制排斥反应的发生。
   
角膜移植术后角膜共焦显微镜活体、动态、连续的观察创伤愈合的过程。1989年，Cavangh等[6]将共焦显微镜次应用于活体人类眼球的研究。激光共焦显微镜可对角膜进行无创伤、实时活体检查,具有高清晰度、确切的深度定位、时间动态观察、纵向断层扫描等优势[7]，从而使人们可在细胞水平上对活体角膜的病理改变进行直接的动态观察。角膜移植术后4d，对照组与实验组角膜共焦检查均可见基质细胞水肿，基质层炎性细胞浸润，提示手术创伤反应相似。随角膜移植术后时间延长，至术后14d，角膜共焦检查对照组与实验组均可见细胞水肿、瘢痕形成，提示两组手术创伤反应伴随组织修复，但实验组角膜细胞较对照组减少明显。至术后21～28d，角膜共焦检查提示对照组手术创伤所致的炎性反应趋于消退，而实验组共焦检查见细胞变形、丢失及炎性细胞的浸润、新生血管长入植片，表现为炎性反应加重，结合裂隙灯检查见植片混浊水肿、新生血管长入，诊断为排斥反应。我们发现，对照组与实验组在术后初期角膜共焦检查未见明显差异，创伤愈合表现为手术创伤所致炎性反应的减轻，间杂瘢痕形成等修复反应。实验组细胞外渗出及角膜细胞丢失较明显。排斥反应发生时，实验组共焦检查可见新生血管长入植片，供体细胞变性坏死及较多炎性细胞浸润。
   
林跃生等[8]对人角膜移植排斥反应的共焦显微镜观察为，移植片边缘的新生血管扩张，血管壁上可见蠕动的、胞体较小而反光度强的细胞。与此同时，角膜移植片的各层细胞也有相应的改变，上皮表层及基质细胞出现胞体肿胀，胞核模糊，表皮细胞出现由于坏死脱落形成的空泡状等改变；基质细胞出现胞核拉长，细胞间隙加宽，炎症细胞浸润于基质细胞之间；内皮细胞出现形态改变以及炎症细胞浸润等。Cho等[9]用共焦显微镜观察兔的角膜同种异体移植排斥反应，亦发现小的炎症细胞的聚集及角膜细胞的丢失破坏。Cavangh等[10]发现：当排斥反应发生时，角膜各层细胞均有特征性的改变，即各层细胞破坏的同时伴有明显的免疫细胞浸润，其它原因造成的角膜水肿（如进行性或继发性炎症、慢性进行性内皮功能衰竭、上皮内长、慢性高眼压等）无明显的免疫细胞浸润[11]。
   
我们活体动态的观察发现，排斥反应一旦启动，植片中浸润的炎症细胞会逐渐增多，提示炎症细胞的浸润是启动、诱发、加剧排斥反应的一个重要因素。炎症细胞到达角膜植片，植片各层的角膜细胞开始受到攻击，发生变性、坏死、脱落等，终植片混浊。新生血管长入植片，可能与炎性因子的诱导、调控血管新生的因子的不平衡等局部免疫微环境的改变有关，也与过强的炎症反应使植片持续水肿、机械屏障作用减轻有关。共焦检查发现植片新生血管扩张，管壁内见蠕动的细胞，提示部分炎症细胞可能从新生血管游离而来，新生血管被诱导形成后，运送炎性细胞参与免疫排斥反应。新生血管的持续存在可能参与并加剧排斥反应。总之碱烧伤后角膜移植免疫排斥反应的高发率与植床的血管化和炎症背景有关。共焦显微镜观察角膜移植排斥反应，发现炎症细胞的聚集、角膜细胞的丢失破坏、新生血管长入植片。炎性细胞的浸润及新生血管的形成是参与排斥反应的重要因素。角膜共焦显微镜动态的观察角膜植片创伤愈合反应，提供活体细胞病理学依据，有效提高角膜移植排斥反应的诊治水平。

【参考文献】
 
1 Williams KA, Muehlberg SM, Lewis RF, et al. How successful is corneal transplatation? A report from the Australian corneal graft register. Eye1995;9:219227

2　邱培瑾,姚克,陈茂华,等.羊膜移植抑制兔角膜碱烧伤后新生血管增殖的研究.眼科研究 2004;22:243245

3　Holland EJ, Chan CC, Wetzig RP, et al. Clinical and immunohistologic studies of corneal rejection in rat penetrating keratoplasty model. Cornea1991;10:374380

4　李志杰，彭广华，李辰.眼免疫性疾病.郑州:河南科学技术出版社1995:133136

5　高晓唯,李霞,任兵,等.角膜移植排斥反应中ICAM1含量的变化.国际眼科杂志 2007;7(6):15811583

6　Cavanagh HD, Jester JV, Essepian J, et al. Confocal microscopy of the living eye. CLAO J1990;16:6573

7　李文娟,黄振平,李仲群,等. 激光共焦显微镜观察兔眼角膜缘干细胞缺乏羊膜移植后的形态. 国际眼科杂志2007;7(3):671674

8　林跃生，孙明霞，陈家祺,等.角膜移植排斥反应的共焦显微镜研究.中国实用眼科杂志 2001;19（8）:592595

9 　Cho BJ, Gross SJ, Pfister DR, et al. In vivo confocal microscopic analysis of corneal allograft rejection in rabbits. Cornea1998;17（4）:417 422

10 　Cavanagh HD, Petroll WM, Alizadeh H, et al. Clinical and diagnostic use of in vivo confocal microscopy in patients with corneal disease. Ophthalmology1993;100(10):14441454

11　李琦,席兴华.角膜移植免疫排斥反应防治的研究进展.国际眼科杂志 2006;6(5):11261129